遺伝子改変マウス作製方法の詳細

詳細はこちらもご参照ください

ゲノム編集技術を用いた遺伝子改変マウスの作製

KO (knock-out) マウスの作製方法の詳細

 

ノックアウトしたい遺伝子のcrRNA配列を、アルゴリズムに基づき決定します。1つの遺伝子について、複数(通常3箇所、少なくとも2か所)のcrRNAをご提案します。

その中で候補としたcrRNA配列をご依頼者様でご購入いただき、代理店を通して直接当研究所にご送付ください。
*注: Cas9 と tracrRNA につい ては、当施設で所有しているため購入の必要はありません。

ご依頼者様でcrRNAの切断対象部分のgenome DNA をPCR増幅 (切断部位を中心に500bpくらい)し、シークエンスでcrRNA部位が保たれていることをご確認後、RNase free の状態で実験動物研究所にご送付ください。量は500ng位を目安にしてください。

到着したcrRNAとPCR産物にtracrRNAとCas9タンパク質を加えて、in vitro digestion (IDA) を実施し、各々のcrRNAの切断効率を評価します。その結果をご依頼者様にご報告し、最も良いと思われるcrRNAを選択します。

 

選択したcrRNAを至適濃度に調整し、tracrRNAとCas9タンパク質と共に約100個のC57BL/6の受精卵前核にインジェクションします。

同一遺伝子に対する異なる複数のcrRNAそれぞれを、インジェクションすることも別途可能です(1つのcrRNAにつき約100個の受精卵にインジェクションします)。

 

KI (knock-in) マウスの作製方法の詳細

 

KI マウスの作製は、KO マウスの作製に準じます。上記の『KO (knock-out)マウス作製方法の詳細』をご参照ください。

KO マウスの作製と異なる点として、KIマウスの作製ではインジェクションの際に、crRNA, tracrRNA, Cas9 に、置換・挿入用の ss ODN (single strand oligo donor DNA)をあわせて導入します。

ssODN は導入 DNA シークエンスを中心に、5′側と 3′側に各々約200 base の arm を付けた配列となります。 これを設計し、crRNAと共に注文して、直接当研究所宛にご送付ください。

*注:ssODN の配列設計については、ご相談に応じますので、ご不明であればご連絡ください。

IDA、インジェクションについては上記の『KO (knock-out)マウス作製方法の詳細』をご参照ください。

 

cKO (condithional knock-out) マウスの作製方法の詳細

 

cKO マウスの作製は、KO マウスとKI マウスの作製に準じます。上記の『KO (knock-out)マウス作製方法の詳細』、『KI (knock-in) マウス作製方法の詳細』をご参照ください。

KO マウス、KI マウスの作製と異なる点として、cKOマウスの作製では、crRNAを欠失させる目的の exon の前後2箇所に設計します。この2種類の crRNAに tracrRNA, Cas9 およびcrRNA切断部位にloxP 配列を組み込んだ ssODN もあわせて導入します。  

ssODN は、crRNA切断部位にloxP 配列を組み込み、5'側と3'側に各々約 200 base の arm を付けた配列となります。これを設計し、crRNAと共に注文して直接当研究所宛にご送付ください。

*注: ssODN の配列設計についてはご相談に応じますので、ご不明であればご連絡ください。

IDA、インジェクションについては上記の『KO (knock-out)マウス作製方法の詳細』をご参照ください。



Tg (transgenic) マウスの作製

Tg マウス作製の詳細

 

トランスジーンやトランスジェニックカセット作製はご依頼者様で行ってください

*注: トランスジーンやトランスジェニックカセットの作製方法はご相談に応じますので、ご不明であればご連絡ください。

トランスジーンについては、プロモーター前とポリAシグナル後で切断し、線状化したDNAをビーズ又はカラムで精製し、凍結乾燥してください。

凍結乾燥したトランスジーン 500ng 程度を当研究所までご送付ください。

PBSで至適濃度に溶解したDNAを、約100個のC57BL/6の受精卵にインジェクションします。